GB/T 42430—2023血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇检验气相色谱法

1 范围

本文件描述了采用顶空气相色谱(HS/GC) 和顶空气相色谱-质谱(HS/GC-MS) 检验血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇的方法。

本文件适用于血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空气相色谱-质谱定性分析和顶空气相色谱定性定量分析。其他体液和非生物样品可参照使用。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GA/T 122 毒物分析名词术语

3 术语和定义

GA/T122 界定的术语和定义适用于本文件。

4 原理

根据乙醇等6种化合物易挥发的特性，经与平行操作的标准物质比较，采用顶空气相色谱(HS/GC) 检测，依据两种不同性质色谱柱的保留时间进行定性，以峰面积为依据，内标法或外标法定量。或采用顶空气相色谱-质谱(HS/GC-MS) 检测，依据保留时间、质谱特征碎片离子进行定性。

5 试剂、仪器和材料

5.1 试剂

5.1.1 水，符合 GB/T 6682 规定的三级。

5.1.2 标准物质：乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇、叔丁醇，纯度均不小于99.5%。

5.1.3 10.0 mg/mL乙醇(甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇)标准物质储备溶液：分别精密称取标准物质乙醇(甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇)适量，用水配制成10.0 mg/mL 标准物质储备溶液，0℃~4℃保存，有效期6个月。实验中所用其他浓度的标准溶液均由10.0 mg/mL 标准储备溶液用水

逐级稀释得到。或采用市售标准物质溶液。

5.1.4 5.0 mg/mL 内标物叔丁醇标准物质储备溶液：精密称取500.0 mg 叔丁醇至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，0 ℃~4 ℃保存，有效期6个月。

5.1.5 0.04 mg/mL内标物叔丁醇工作溶液：精密吸取5.0 mg/mL 内标物叔丁醇标准物质储备溶液0.8 mL至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，0 ℃~4 ℃保存，有效期3个月。

5.2 仪器和材料

5.2.1 气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器(FID)。

5.2.2 气相色谱-质谱仪：配有电子轰击(EI) 源。

5.2.3 电子天平：分度值(d) 小于或等于0.1 mg。

5.2.4 顶空自动进样器。

5.2.5 移液器：1.0 mL 和0.1 mL。

5.2.6 顶空进样瓶：10 mL。

5.2.7 硅橡胶垫。

5.2.8 铝帽。

5.2.9 密封钳。

5.2.10 恒温水浴锅：控温精度士2.0 ℃。

5.2.11 注射器：1 mL。

6 分析步骤

6.1 定性分析

6.1.1 检材样品制备

取检材样品血液或尿液100μL 及0.04 mg/mL 内标物叔丁醇工作溶液500 μL(采用外标法时，以水代替内标物叔丁醇工作溶液)置于顶空进样瓶内，盖上硅橡胶垫，用密封钳加封铝帽，混匀，置于顶空自动进样器样品架上进样，或置于65 ℃恒温水浴中加热10 min, 用 1 mL 注射器吸取瓶内液面上气体0.4 mL,进样。

6.1.2 质控样品制备

取质量浓度为0.10 mg/mL 待测目标物标准溶液100μL, 作为添加样品，与检材样品平行操作。

取水100 μL, 作为空白样品，与检材样品平行操作。

6.1.3 仪器条件

6.1.3.1 气相色谱仪参考条件

用气相色谱法定性时应选用两根不同性质的色谱柱进行分析。

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整。

a) 色谱柱型号可选择但不限于以下四种：

1) BAC1(30m×0.32 mm×1.8μm)柱或等效色谱柱；

2) BAC2(30 m×0.32 mm×1.2 μm)柱或等效色谱柱；

3) ALC1(30m×0.32 mm×1.8 μm)柱或等效色谱柱；

4) ALC2(30 m×0.32 mm×1.2 μm)柱或等效色谱柱。

b) 柱温：恒温40 ℃。

c) 进样口温度：150 ℃。

d) 检测器温度：300 ℃。

e) 载气：氮气。

f) 柱流量：4 mL/min。

6.1.3.2 气相色谱-质谱仪参考条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：

a) 色谱柱：聚乙二醇固定相(30 m×0.32 mm×0.25μm)色谱柱或等效色谱柱；

b) 柱温：42℃保持3 min, 以25℃/min 升温至120 ℃保持4 min;

c) 载气：氦气；

d) 流速：1.25 mL/min;

e) 进样量：0.4 mL;

f) 分流比：10:1;

g) 进样口温度：160 ℃;

h) EI 源电压：70 eV;

i) 溶剂延迟：1.50 min;

j) 离子源温度：230 ℃;

k) 四极杆温度：150 ℃;

1) 接口温度：180℃;

m) 采集方式：全扫描(SCAN);

n) 乙醇等6种化合物及内标物的保留时间与特征碎片离子见表1。

6.1.3.3 顶空自动进样器参考条件

顶空自动进样器参考条件：

a) 加热箱温度：65℃;

b) 定量环温度：105℃;

c) 传输线温度：110 ℃;

d) 气相循环时间：7.5 min;

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GB/T 42430—2023

e) 样品瓶加热平衡时间：10.0 min;

f) 样品瓶加压时间：0.10 min;

g) 定量环平衡时间：0.05 min;

h) 进样时间：1.00 min。

6.1.4 进 样

分别取空白样品、添加样品和检材样品按6.1.3 条件进行检测。进样顺序应确保结果有效。

6.2 定量分析

6.2.1 样品制备

取检材样品血液或尿液100 μL各两份，按6.1.1 操作。

采用单点校正法定量，取与检材样品等量的目标物标准溶液各两份，与检材样品平行操作，得到添加样品，检材样品中目标物浓度应在添加样品中目标物浓度的(100±30)%内。

采用校准曲线法定量，配制系列浓度目标物标准溶液，每个浓度取与检材样品等量的目标物标准溶液各两份，得到系列浓度的添加样品，与检材样品平行操作。检材样品中目标物浓度应在校准曲线的线性范围内，相关系数(r) 不小于0.997。

6.2.2 仪器参考条件

气相色谱仪参考条件见6.1.3.1,顶空自动进样器参考条件见6.1.3.3。

6.2.3 进 样

分别取检材样品、系列浓度的添加样品或单点浓度的添加样品，按6.2.2条件进样分析。

6.2.4 结果计算

6.2.4.1 含量计算

6.2.4.1.1 内标-校准曲线法

记录检材样品和添加样品中目标物和内标物的峰面积值，以添加样品中目标物与内标物的峰面积比为纵坐标、添加样品中目标物的质量浓度为横坐标进行线性回归，得到线性方程。根据检材样品中目标物及内标物的峰面积比，按公式(1)计算出检材样品中目标物的质量浓度。

式中：

w—— 检材样品中目标物的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);

Y—— 检材样品中目标物与内标物叔丁醇的峰面积比；

a 线性方程的截距；

b ——线性方程的斜率。

……… …… (1)

6.2.4.1.2 内标-单点校正法

记录检材样品和添加样品中目标物和内标物的峰面积值，根据检材样品和添加样品中目标物及内标物的峰面积，按公式(2)计算出检材样品中目标物的质量浓度、

式中：

w —— 检材样品中目标物的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);

A —— 检材样品中目标物的峰面积；

A′—— 添加样品中目标物的峰面积；

A;—— 检材样品中内标物的峰面积；

A 添加样品中内标物的峰面积；

w’—— 添加样品中目标物的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。

6.2.4.1.3 外标-校准曲线法

记录检材样品和添加样品中目标物的峰面积值，以添加样品中目标物峰面积为纵坐标、添加样品中目标物的质量浓度为横坐标进行线性回归，得到线性方程。根据检材样品中目标物的峰面积，按公式(3)计算出检材样品中目标物的质量浓度。

式中：

o ——检材样品中目标物的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);

Y—— 检材样品中目标物的峰面积；

a ——线性方程的截距；

b ——线性方程的斜率。

… … ……(3 )

6.2.4.1.4 外标-单点校正法

记录检材样品和添加样品中目标物的峰面积值，根据检材样品和添加样品中目标物的峰面积，按公式(4)计算出检材样品中目标物的质量浓度。

式中：

w —— 检材样品中目标物的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);

A —— 检材样品中目标物的峰面积；

w’—— 添加样品中目标物的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);

A′—— 添加样品中目标物的峰面积。

…………… ……(4 )

6.2.4.2 相对相差计算

记录两份平行操作的检材样品含量，按公式(5)计算相对相差。

公式中：RD —— 相对相差；

…… …… (5)

w1、o2——两份检材样品平行定量测定的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。

》 ——两份检材样品平行定量测定的质量浓度的平均值，单位为毫克每毫升(mg/mL)。

6

7 结果评价

7.1 定性分析结果评价

7.1.1 顶空气相色谱法定性结果评价

阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与添加样品一致(相对误差在士1%之内),空白样品无干扰，且经选用不同性质的色谱柱进行分析，结果一致，则可判断检材样品中检出目标物。乙醇等6种化合物及内标物的气相色谱图见附录 A 中 图 A.1～ 图 A.4。阴性结果评价：检材样品未出现与添加样品目标物一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。

7.1.2 顶空气相色谱-质谱法定性结果评价阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与添加样品一致(相对误差在±1%之内),且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物特征碎片离子(不少于3个)与添加样品一致，离子丰度比与浓度接近的添加样品相比，相对误差不超过表2规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。阴性结果评价：检材样品未出现与添加样品目标物一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。

7.2 定量分析结果评价

两份检材样品中目标物含量的相对相差不大于1 0 % (有凝血的血样不大于1 5 % ) ,定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。检材样品中目标物含量的相对相差大于10%(有凝血的血样大于15%),定量数据不可靠，应按6.2重新测定。

乙醇和甲醇中毒参考资料见附录 B 和附录

附 录 A

(资料性)

血液、尿液中乙醇等化合物的气相色谱图、校准曲线、检出限和定量限

A.1 乙醇等6种化合物及内标物的气相色谱图

乙醇等6种化合物及内标物的气相色谱图见图 A.1～ 图 A.4。

标引序号说明：

1——甲醇(1.154 min);

2——乙醇(1.450 min);

3——异丙醇(1.755 min);

4——叔丁醇(2.069 min);

5——正丙醇(2.310 min);

6——丙酮(2.542 min);

7——正丁醇(4.458 min)。 图 A.1 在色谱柱(1)参考条件下乙醇等6种化合物及内标物的气相色谱图

A.2 乙醇的参考校准曲线

配制乙醇质量浓度为0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL的标准溶液，按6.2分析，以乙醇与内标物叔丁醇的峰面积比(Y) 为纵坐标、乙醇质量浓度(w) 为横坐标进行线性回归。得线性回归方程 Y=1.2409w—0.0462 (色谱柱1) ,Y=1.216 lw-0.0578(色谱柱2) ,Y=1.0307w-0.0276 (色谱柱3) ,Y=1.0287w-0.013 (色谱柱4) ,r 均不小于0.997。

若检材样品的浓度超出线性范围，需用水稀释检材样品或重新制作校准曲线，使检材样品的浓度在校准曲线的线性范围内。

A. 3 检出限和定量限

本文件的 HS/GC 方法检出限除正丙醇为0.005 mg/mL 外，其余化合物均为0.05 mg/mL; 定量限均为0.10 mg/mL。

本文件的 HS/GC-MS 方法检出限均为0.05 mg/mL。

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